В конце XIV – начале XV века в городе насчитывалось около 2 тысяч жителей, развивались ремесла (гончарство, кожевенное, кузнечное, деревообработка, ювелирное и др.), брестские купцы вывозили в Европу меха, кожу, лес, пеньку, зерно.

В 1409 году в Бресте состоялась встреча польского короля Ягайло и великого князя литовского Витовта, чтобы обсудить детальный план войны с Тевтонским орденом. 15 июля 1410 года состоялась Грюнвальдская битва, в которой участвовал и брестский полк (брестская хоругвь).

В Бресте активно развивались торговля и ремесла. Был построен мост через Западный Буг. Началось строительство первой на территории Беларуси синагоги.

В 1413 году образовано Берестейское (Брестское) староство в составе Трокского воеводства, Брест получил статус главного города староства. К концу XV века в Бресте проживало около 5 тысяч человек.

В 1520 году Брест стал центром Брестского повета в составе Подляшского воеводства.

В середине XVI века город представлял собой крупный торгово-ремесленный центр (насчитывалось 56 ремесленных специальностей), имелось 26 улиц, более 1000 деревянных домов.

При брестском старосте Николае Радзивилле Черном Брест стал центром книгопечатания: в основанной им первой на территории Беларуси типографии было издано 40 книг, в том числе в 1563 году Брестская (Радзивилловская) Библия.

В 1566 году учреждено Брестское воеводство с центром в Бресте.

После Люблинской унии 1569 года между Великим княжеством Литовским и Королевством Польским образовалось федеративное государство Речь Посполитая, в составе которой оказался и Брест. Через Брест проходил королевский тракт, соединявший Краков и Вильно.

Население города постепенно начало увеличиваться за счет переселенцев из Польши, Германии, России. К середине XVII века население Бреста составляло более 10 тысяч человек. В городе действовали 14 цехов, объединявших представителей 48 профессий. Брест вел активную торговлю с другими городами и странами.

С Брестчиной связано важное событие в религиозной и общественной жизни Беларуси. Именно здесь в 1596 году была заключена Брестская церковная уния об объединении католической и православной церквей на территории Речи Посполитой.

В XVII веке в городе появились представители различных католических монашеских орденов: бернардинцев, иезуитов и др. Экспансия католической церкви вызывала протесты православного населения, создавались православные братства.

Город неоднократно становился ареной военных действий: во время восстания Богдана Хмельницкого (1648 г.), русско-польской войны (1654-1667 гг.), Северной войны (1700-1721 гг.). Разрушения были настолько велики, что Сейм освобождал город от налогов на несколько лет.